實驗一：肝素 (Heparin)

中南大學湘雅三醫(yī)院呂奔教授團隊圍繞膿毒癥的發(fā)病機理及靶向干預開展了系列研究，揭示了膿毒癥重要的致病機制，為膿毒癥的診治提供了潛在的生物標志物和藥物干預靶點，并針對該靶點進行藥物篩選，為今后膿毒癥的防治提供了新的思路。

2021年，呂奔教授研究團隊在Immunity雜志上發(fā)表文章，針對前序研究中發(fā)現(xiàn)的HMGB1-LPS-caspase-11途徑，篩選出肝素 (Heparin) 能高效并選擇性地抑制Caspase-11活化，并闡明了肝素在膿毒癥中能通過抑制Caspase-11的活化防止臟器損傷、DIC發(fā)生和死亡的機制。

觀察圖1的動力學表征數(shù)據(jù)可知，肝素與HMGB1有較強結(jié)合，Kd=5.59*10^^-6 M。同時，通過多濃度梯度進樣的實驗設(shè)計，可以看出LPS+Heparin實驗組相較LPS對照組，與包被有HMGB1蛋白的芯片的響應(yīng)值 (Response, RU) 顯著降低，即可看出Heparin可以抑制LPS與HMGB1的識別/結(jié)合。

實驗二：Tuftsin

北京大學王月丹與初明教授團隊圍繞著新冠病毒的防治工作篩選到了一種天然產(chǎn)物Tuftsin，相關(guān)成果也于2022年發(fā)表在Frontiers in Molecular Biosciences雜志上。Tuftsin是機體脾臟產(chǎn)生的一段生理活性肽，其基本功能是刺激巨噬細胞和粒細胞，提高促吞噬的能力；可以通過增強效應(yīng)細胞的細胞毒功能殺傷腫瘤細胞等，在抗感染方面具有不能替代的作用。

通過多輪的化藥庫篩選、分子對接等實驗，課題組篩選到Tuftsin分子。隨后，使用Biacore體外驗證了其與ACE2分子及抑制的效應(yīng)分子NRP1的親和力，結(jié)果表明Tuftsin能特異性識別并結(jié)合ACE2分子。

此外，研究人員通過多濃度梯度進樣的實驗設(shè)計，將S1蛋白固定在CM5芯片上，設(shè)置ACE2 (5 nM) 對照組及Tuftsin+ACE2（ACE2為固定濃度，5 nM; Tuftsin設(shè)置9/156/625 nM）實驗組；結(jié)果表明，Tuftsin濃度越高，結(jié)合響應(yīng)值 (Response, RU) 越低，即證明Tuftsin可有效阻斷/抑制S1與ACE2的識別與結(jié)合。

實驗三：黃連素 (Berberine，BBR) 

首都醫(yī)科大學和北京中醫(yī)藥大學的科研團隊在傳統(tǒng)中藥中篩選特異性抑制凝血酶的小分子抑制劑，最終得到的黃連素 (Berberine，BBR) 被證明可以直接結(jié)合凝血酶從而抑制其誘導的血小板聚集。凝血酶 (Thrombin) 是血液凝固級聯(lián)反應(yīng)中的關(guān)鍵酶，被認為是多種心血管疾病中重要的藥物靶點。

研究人員首先在Biacore上證明了Berberine可以直接與凝血酶結(jié)合，兩者的親和力為16.39 μM（圖3 A/B），比已上市的抗凝血藥阿加曲班 (Argatroban) 的親和力更高（圖3 C/D，KD=53.78 μM）。

同時，研究人員利用Biacore的A-B-A進樣設(shè)計競爭實驗，證明Berberine與Argatroban結(jié)合在Thrombin相同的位點上。A-B-A的進樣方式簡化了競爭實驗的設(shè)置，允許兩種不同的溶液按照溶液A/溶液B/溶液A的順序在同一個循環(huán)內(nèi)進樣，由于競爭樣品無需再溶解在運行緩沖液里，大大減少了競爭樣品的消耗量，非常適用于藥物的競爭分析（圖4）。

從圖5的實驗結(jié)果中可以看到：Berberine不存在時，Argatroban與Thrombin有明顯的結(jié)合信號（圖5，red line）；而在300 μM Berberine存在的情況下（A-B-A樣品設(shè)置參照圖4），Argatroban與Thrombin的結(jié)合響應(yīng)值明顯降低（圖5，blue line）。證明Berberine在Thrombin上的結(jié)合位點與Argatroban是一樣的。綜合后續(xù)的血小板凝集實驗，這一研究說明Berberine是潛在的安全有效的凝血酶抑制藥物。

實驗一：紫草素 (SHK)

NF-κB是一個可誘導轉(zhuǎn)錄因子家族，調(diào)節(jié)多種生理及病理進程。NEMO/IKKβ復合物則是NF-κB信號通路中的中心調(diào)節(jié)劑。2022年，大連醫(yī)科大學馬驍馳、中國科學院上海藥物研究所果德安、中國科學院大連化學物理研究所葉明亮課題組在Signal Transduction and Targeted Therapy雜志上發(fā)表了相關(guān)成果，篩選到NEMO/IKKβ復合物的潛在抑制劑-紫草素 (SHK) 。

為測得SHK抑制NEMO/IKKβ復合物的IC₅₀，課題組做了相關(guān)實驗：把MBP-IKKβ蛋白固定在CM5芯片上，再將GST-NEMO+SHK（GST-NEMO為固定濃度，1 μM; SHK設(shè)置0~3125 nM）的預混液以多濃度梯度進樣的形式流過芯片表面，進行結(jié)合信號的采集，擬合作圖，測出IC₅₀。

同時，課題組考慮到實驗的嚴謹性，將GST-NEMO作為固定相進行了實驗重復。課題組使用Biacore測得了紫草素抑制NEMO/IKKβ復合物的IC₅₀為174 nM，證明其可在體內(nèi)外抑制NF-κB通路，從而減緩結(jié)直腸癌細胞的增殖，為開發(fā)有效的小分子PPI抑制劑提供一些新的思路。

倫斯勒理工學院、中國農(nóng)業(yè)大學等單位圍繞著綠茶中的抗氧化劑EGCG展開了豐富的研究，并于2021在NATURE COMMUNICATIONS雜志上發(fā)表相關(guān)成果。文章中闡釋EGCG可與p53分子結(jié)合并阻斷p53與MDM2分子（E3泛素連接酶）的結(jié)合，從而抑制MDM2對p53的泛素化、穩(wěn)定了p53的抗腫瘤活性。

課題組首先使用Biacore測定了EGCG與全長p53、NTD-p53的親和力，探明了EGCG與p53的識別作用靶點位于p53分子的N末端。同時，課題組將MDM2分子固定在CM5芯片上，探究了MDM2分子與p53的親和力KD=0.6±0.1 μM。接著使用同一張芯片展開了IC₅₀測試：將p53+EGCG（p53為固定濃度，250 nM; EGCG設(shè)置0~500 nM）的預混液以多濃度梯度進樣的形式流過芯片表面，進行結(jié)合信號的采集，擬合作圖，測出IC₅₀=0.2 μM。

小結(jié)