來源：以下文章來源于Cytiva思拓凡 ，作者Li Yafei

2023年2月25日，中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)發(fā)布了2022年中醫(yī)藥十大學(xué)術(shù)進(jìn)展。張伯禮院士指出：2022年度中醫(yī)藥十大學(xué)術(shù)進(jìn)展主要呈現(xiàn)的價(jià)值，就包括“重視新技術(shù)新方法在中醫(yī)藥中的應(yīng)用”。北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部曾克武教授和屠鵬飛教授與浙江大學(xué)、大連醫(yī)科大學(xué)、博奧生物研究團(tuán)隊(duì)?wèi){借“新技術(shù)助力中藥功效科學(xué)內(nèi)涵闡釋”共同獲選2022年度中醫(yī)藥十大學(xué)術(shù)進(jìn)展。

中醫(yī)藥研究者中有廣泛的Biacore用戶基礎(chǔ)，曾克武教授和屠鵬飛教授團(tuán)隊(duì)的這一成果里自然也有Biacore的身影。接下來就讓小編帶您領(lǐng)略Biacore這一現(xiàn)代科技，如何與傳統(tǒng)中醫(yī)藥碰撞并融合，從而闡釋中藥功效科學(xué)的內(nèi)涵。

天然產(chǎn)物中抗腫瘤活性分子

發(fā)現(xiàn)及作用機(jī)制揭示1

腫瘤免疫微環(huán)境（Tumor immune microenvironment ，TIME）調(diào)控因子IGF2BP1是一種關(guān)鍵N6 -甲基腺苷 (m6A) 閱讀蛋白，識別m6A靶點(diǎn)轉(zhuǎn)錄物，被認(rèn)為是腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)。2022年曾克武教授和屠鵬飛教授團(tuán)隊(duì)發(fā)表的研究成果中，發(fā)現(xiàn)了天然產(chǎn)物葫蘆素B通過結(jié)合IGF2BP1發(fā)揮抗腫瘤作用，并且闡釋了作用機(jī)制。

以IGF2BP1為出發(fā)點(diǎn)，作者首先發(fā)現(xiàn)，在小鼠H22荷瘤模型中敲低IGF2BP1，可以通過免疫細(xì)胞招募和降低TIME中PD-L1的表達(dá)來抑制肝細(xì)胞癌的進(jìn)展。使用Biacore 8K，作者驗(yàn)證了IGF2BP1與甲基化單鏈RNA（ss-m6A）的強(qiáng)親和力，達(dá)到了18.3 nM。并且發(fā)現(xiàn)，IGF2BP1與非甲基化RNA（ss-A）的親和力則低了13倍。

確定了治療靶點(diǎn)之后，作者使用Biacore 8K，直接從包含889種化合物的中藥天然產(chǎn)物庫中篩選能抑制IGF2BP1與其m6A靶點(diǎn)的活性分子。通過合成生物素標(biāo)記的ss-m6A，作者將RNA直接固定在芯片上，將化合物固定濃度（20 μM）與IGF2BP1預(yù)孵育，檢測RNA與化合物- IGF2BP1的結(jié)合信號，從而直接篩選出具有抑制效果的天然產(chǎn)物（圖1）。

圖1：Biacore 8K抑制劑篩選方法示意圖

通過Biacore 8K的高通量抑制劑篩選實(shí)驗(yàn)，作者得到了抑制劑篩選的排序。從圖2中可以直觀看出，六種具有較強(qiáng)抑制效果的天然產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)，其中抑制效果最強(qiáng)的當(dāng)屬葫蘆素B（CuB）。在Huh增殖抑制實(shí)驗(yàn)中，葫蘆素B同樣表現(xiàn)出了抑制作用，72h時(shí)的IC50達(dá)到1.0 uM。

圖2：Biacore 8K抑制劑篩選結(jié)果

高通量篩選+精確表征，在藥物研究的各個(gè)階段都少不了Biacore。在篩選得到葫蘆素B后，作者當(dāng)然同樣使用Biacore精確表征了IGF2BP1與葫蘆素B的親和力。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，二者的親和力達(dá)到了1.2 μM，與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相互印證（圖3）。

圖3：Biacore精確表征IGF2BP1與CuB的親和力

葫蘆素B又是什么呢？

葫蘆素B是從葫蘆科等植物中分離得到的一類四環(huán)三萜類化合物，具有廣泛的藥理活性。以葫蘆素B為主要成分的葫蘆素制劑在臨床治療濕熱毒盛所致的遷延性肝炎、肝硬化和原發(fā)性肝癌具有確切療效。中藥研究，除了根據(jù)已知靶點(diǎn)從天然產(chǎn)物庫中找活性分子外，另一個(gè)角度則是已知活性分子，尋找作用靶點(diǎn)。在通過抑制劑篩選及表征，從靶點(diǎn)IGF2BP1出發(fā)找到活性分子葫蘆素B后，作者使用“鉤釣”的方法，驗(yàn)證是否能利用葫蘆素B“鉤”出靶點(diǎn)IGF2BP1。

作者首先合成了葫蘆素B分子探針，然后利用pull-down + 質(zhì)譜的方法從Huh細(xì)胞裂解液中成功“鉤”到了靶點(diǎn)IGF2BP1，并且在免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)中證明了細(xì)胞中葫蘆素B與IGF2BP1的結(jié)合。至此，不論是從靶點(diǎn)出發(fā)找活性分子，還是從活性分子出發(fā)找靶點(diǎn)，雙管齊下，作者明確了葫蘆素B與腫瘤免疫微環(huán)境調(diào)控因子IGF2BP1的直接結(jié)合。

為了進(jìn)一步闡釋葫蘆素B的抗腫瘤機(jī)制，作者研究了IGF2BP1上葫蘆素B的結(jié)合位置及結(jié)合方式。將IGF2BP1的結(jié)構(gòu)域逐一刪除后，作者發(fā)現(xiàn)只有缺失了C端KH結(jié)構(gòu)域會(huì)使IGF2BP1與葫蘆素B不能結(jié)合。通過質(zhì)譜、pull-down、BLAST、CD等多種方法，作者最終確定，葫蘆素B通過邁克爾加成反應(yīng)結(jié)合在IGF2BP1中KH1?2結(jié)構(gòu)域的Cys253上，并且會(huì)引起IGF2BP1的構(gòu)象變化。

那么葫蘆素B又是如何影響IGF2BP1的功能呢？

IGF2BP1本身會(huì)與ss-m6A結(jié)合，前面作者使用Biacore做了二者抑制劑的高通量篩選，得到了葫蘆素B。高通量抑制劑篩選能做，單獨(dú)的抑制劑表征當(dāng)然手到擒來。作者設(shè)置了Biacore實(shí)驗(yàn)來從生化角度上表征葫蘆素B的抑制效果。從結(jié)果可以看出，隨著葫蘆素B的濃度逐漸提高，IGF2BP1與ss-m6A的結(jié)合信號越來越低（圖4）。Biacore結(jié)果與RNA pull-down實(shí)驗(yàn)一致，明確了葫蘆素B可以抑制二者結(jié)合。

圖4：Biacore實(shí)驗(yàn)明確葫蘆素B抑制IGF2BP1與ss m6A的結(jié)合

后續(xù)作者還發(fā)現(xiàn)，葫蘆素B可以降低與IGF2BP1所結(jié)合的mRNA（包括c-MYC、KRAS 等mRNAs）穩(wěn)定性，在體內(nèi)通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，招募免疫細(xì)胞到腫瘤微環(huán)境，阻斷PD-L1的表達(dá)，最終表現(xiàn)出明顯的抗腫瘤效果（圖5）。

圖5：文章主要研究路線及作用機(jī)制概述

曾克武教授和屠鵬飛教授團(tuán)隊(duì)專注于天然活性分子治療各類型重大疾病的發(fā)現(xiàn)及機(jī)制闡釋，開發(fā)了包括分子探針、蛋白芯片2在內(nèi)的多種靶點(diǎn)“鉤釣”技術(shù)，多年以來，許多研究成果中均使用了Biacore作為生物分子相互作用檢測技術(shù)。中國科學(xué)院院士陳凱先教授指出：年度的學(xué)術(shù)進(jìn)展是中醫(yī)藥學(xué)術(shù)研究的“指南針”和“風(fēng)向標(biāo)”。相信此次研究成果的入選，也將為廣大中醫(yī)藥研究者提供更多研究思路，對“積極推進(jìn)中醫(yī)藥科研和創(chuàng)新，推動(dòng)傳統(tǒng)中醫(yī)藥和現(xiàn)代科學(xué)結(jié)合”有重要意義。

Biacore

作為現(xiàn)代化的體外分子互作“金標(biāo)準(zhǔn)”，以其超高的靈敏度，超高的數(shù)據(jù)質(zhì)量，無分子量檢測下限，適用于各類型的天然產(chǎn)物及生物分子研究，在中醫(yī)藥研究者中有廣泛的用戶基礎(chǔ)。Biacore將持續(xù)與廣大中醫(yī)藥研究者勠力同心，共同推動(dòng)中醫(yī)藥的現(xiàn)代化研究和應(yīng)用。

Biacore，for a better life

參考文獻(xiàn)：

[1] Liu Y ,  Guo Q ,  Yang H , et al. Allosteric Regulation of IGF2BP1 as a Novel Strategy for the Activation of Tumor Immune Microenvironment[J].  2022.

[2] Zhang et al. Neuroinflammation inhibition by small-molecule targeting USP7 noncatalytic domain for neurodegenerative disease therapy, Sci. Adv. 8, eabo0789 (2022)