近日，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所王曉鈞團(tuán)隊(duì)在《PLoS Pathogens》雜志刊載了題為 「Selective usage of ANP32 proteins by influenza B virus polymerase: Implications in determination of host range」的文章。該文章系統(tǒng)性地揭示了 B 型流感病毒感染的種間限制機(jī)制，發(fā)現(xiàn)宿主 ANP32A&B 蛋白是決定 B 型流感病毒聚合酶活性的須關(guān)鍵因子。

甲型流感病毒（IAV）和乙型流感病毒（IBV）屬于正粘病毒科。禽類作為 IAV 的重要宿主，經(jīng)常將 IAV 跨物種傳播給哺乳動(dòng)物。而 IBV 與 IAV 復(fù)制機(jī)制類似且受體相同，卻少有禽類自然感染 IBV 的報(bào)道，這說明 IBV 在禽類體內(nèi)無法復(fù)制，但具體機(jī)制尚不明確。

圖 2   乙型流感病毒結(jié)構(gòu)示意圖

前期研究已經(jīng)證明，宿主 ANP32A&B 蛋白在  IAV 聚合酶活性中起到關(guān)鍵性作用，那么 ANP32 蛋白是否在 IBV 的復(fù)制中也具有類似的功能呢？不同物種的 ANP32 蛋白是否為 IBV 提供不同的支持？

研究團(tuán)隊(duì)構(gòu)建出不同的細(xì)胞系，利用聚合酶雙熒光報(bào)告系統(tǒng)等技術(shù)，獲得重大發(fā)現(xiàn)，其中兩點(diǎn)尤為突出：

1.ANP32A、ANP32B 對(duì)于 IBV 的復(fù)制起主要作用，ANP32E 的作用相對(duì)有限；

2.哺乳動(dòng)物 ANP32A&B 蛋白可以完全支持 IBV 聚合酶復(fù)制，而禽類 ANP32A 由于有 33 個(gè)氨基酸的插入以及禽類 ANP32B 由于 129/130 位點(diǎn)的突變，導(dǎo)致禽類 ANP32A&B 均無法支持 IBV 的復(fù)制。

為進(jìn)一步探索不同物種 ANP32 蛋白支持 IBV 聚合酶活性差異的分子機(jī)制，該研究利用 Co-IP，以及基于 Biacore 的表面等離子共振 SPR 等技術(shù)進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。

Co-IP 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示： huANP32A 和  chANP32A 對(duì)于 IBV 聚合酶具有相似的結(jié)合能力，但無法給出定量的結(jié)合差異分析。為了解決這個(gè)問題，研究人員使用 Biacore  對(duì) IBV 聚合酶與 ANP32 蛋白進(jìn)行動(dòng)力學(xué)/親和力表征。

研究人員使用 CM5 芯片氨基偶聯(lián) Anti-His 抗體自制 Anti-His 捕獲芯片，隨后流經(jīng)含有 His-IBV 聚合酶的細(xì)胞裂解液，捕獲 His-IBV 聚合酶。然后將 ANP32 蛋白稀釋到一系列濃度作為流動(dòng)相，使用 Biacore T200 對(duì)聚合酶與 ANP32 蛋白進(jìn)行動(dòng)力學(xué)/親和力表征。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：與 Co-IP 結(jié)果一致，huANP32A，chANP32A 和 huANP32A + 33 在 0.15625-5μM 的濃度下均能與病毒聚合酶結(jié)合（圖 4A – 4C）。相反，huANP32A_165T 幾乎不與聚合酶結(jié)合（圖 4D）。在另一個(gè)僅將兩個(gè)聚合酶亞基（PA 和 PB1）固定在 CM5 芯片上的對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，在 huANP32A 和病毒聚合酶亞基之間未檢測(cè)到特異性親和力（圖 4E）。

通過 Biacore 分析計(jì)算得出 huANP32A，chANP32A 和 huANP32A+ 33 的解離平衡常數(shù)（KD）有著顯著差異。huANP32A 與 IBV 聚合酶結(jié)合，KD = 0.05418μM，幾乎比 chANP32A 低 3 倍。插入 33 個(gè)氨基酸的 huANP32A 和聚合酶結(jié)合的 KD 值也從 0.05418μM 增加到 0.1013μM（圖 4F）。盡管 huANP32A，chANP32A 和 huANP32A + 33 具有相似的解離速率常數(shù)（kd），但結(jié)合速率常數(shù)（ka）卻截然不同。huANP32A 與 His-IBV 聚合酶結(jié)合的 ka 值是其他兩種蛋白質(zhì)的 ka 值的兩倍。

該結(jié)果表明，與 ChANP32A 相比，huANP32A 對(duì) IBV 聚合酶具有更強(qiáng)的結(jié)合親和力，并且 33 個(gè)氨基酸的插入降低了 ANP32A 與 IBV 聚合酶的結(jié)合親和力。

圖 4 IVB 聚合酶與 ANP32 蛋白互作 Biacore 結(jié)果

該研究揭示了哺乳動(dòng)物 ANP32 家族蛋白是支持 IBV 復(fù)制的關(guān)鍵宿主蛋白，并明確了禽類 ANP32 蛋白無法支持病毒聚合酶活性的分子機(jī)制（圖 5）。對(duì)理解 IBV 聚合酶功能、作用機(jī)理和宿主范圍決定因素具有重要意義，同時(shí)可為抗 IBV 藥物靶點(diǎn)設(shè)計(jì)和跨物種傳播的防控提供理論依據(jù)。

圖 5 IAV 和 IBV 聚合酶對(duì) ANP32 蛋白的選擇性使用及其分子基礎(chǔ)

縱觀全文，Biacore 的技術(shù)優(yōu)勢(shì)清晰易見

1、Biacore 區(qū)分出不同物種、不同氨基酸結(jié)構(gòu)的同源蛋白與 IBV 聚合酶相互作用的細(xì)微差異，這是 Co-IP 等同類技術(shù)所不具備的，充分體現(xiàn)出 Biacore的分辨率。

2、Biacore 互作信息，幫助研究人員從 KD、ka、kd 等方向表征分子相互作用，定量地闡釋不同分子之間相互作用的異同點(diǎn)，從而幫助科研人員好的闡明相關(guān)的分子機(jī)制。

3、利用 Biacore 可以直接捕獲粗樣品中的目的蛋白，并進(jìn)行親和力動(dòng)力學(xué)的表征。這這篇文章中，研究人員利用 Anti-His 捕獲芯片，能夠從細(xì)胞裂解液中直接捕獲 His-IBV 聚合酶，并檢測(cè)其與 ANP32 蛋白的互作。這樣只需要純化一種蛋白即可進(jìn)行的親和力動(dòng)力學(xué)表征，降低了樣品準(zhǔn)備時(shí)間與難度。

自 1990 年上市自今，Biacore 經(jīng)過 30 年的發(fā)展，已經(jīng)成為分子互作檢測(cè)的「金標(biāo)準(zhǔn)」，廣泛應(yīng)用到基礎(chǔ)科研與藥物開發(fā)的多個(gè)領(lǐng)域，累計(jì)發(fā)表的文章已經(jīng)過四萬篇，過 80% 的上市抗體藥物在研發(fā)、申報(bào)與生產(chǎn)中都使用了 Biacore。